### 破骨细胞的诱导过程

破骨细胞的诱导是通过破骨前体细胞的融合形成多核巨细胞。在这一过程中，细胞的密度对融合至关重要。人类破骨细胞的体外分化通常是通过单核细胞进行诱导。这些细胞由于是经过分选的，因此纯度非常高，并且在诱导分化过程中不会增殖。这使得其细胞密度可控，从而提高了诱导成功率。相较之下，小鼠的破骨细胞体外诱导分化是选择骨髓细胞进行诱导。虽然骨髓细胞中含有大量的破骨前体细胞，但在诱导分化过程中，其他杂细胞会对细胞之间的融合产生影响。此外，在前期扩增过程中，细胞生长速度的差异最终会导致细胞密度失控，这也会影响细胞融合，从而导致诱导分化的失败。

### 小鼠骨髓细胞的获取

1. 小鼠（6-8周）颈椎脱臼法处死后，将其放入含有酒精的小烧杯中浸泡2分钟进行消毒灭菌。接着在超净台中进行手术，取出所有的胫骨和股骨，并用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净。

2. 将取出的骨头转移至装有无菌PBS的培养皿中，冲洗一次后再转移至另一个装有无菌PBS的培养皿。

3. 用剪刀剪去骨的两端，随后用注射器抽取PBS，针头插入两端骨髓腔中，注入PBS，反复冲洗骨髓直至液体变清。

4. 收集骨髓悬液，并用筛网过滤，去除小碎片和肌肉组织。

5. 将过滤后的液体以500g离心5分钟，棕色上清液被弃去。

6. 将离心后沉淀弹散，加入2ml的红细胞裂解液（1X），在室温下裂解5分钟。推荐使用尊龙凯时红细胞裂解液，其裂解温和，对骨髓细胞损伤小。

7. 加入10ml完全培养基（α-MEM+10% FBS+双抗）以终止裂解，然后再进行离心，弃去上清。

8. 最后用完全培养基重悬细胞，至此已获得小鼠骨髓细胞。

### 巨噬细胞的诱导分化

1. 将细胞重悬于1-2*10⁶/ml，并加入终浓度为30ng/ml的小鼠M-CSF，然后将10ml细胞悬液铺入10cm的细胞培养皿中。隔天更换液体，诱导分化5天，待细胞长至80-90%密度，观察镜下细胞的贴壁生长情况。

2. 弃去培养皿内培养基，加入PBS清洗细胞一次，接着加入一定量的胰酶在37℃进行消化。当细胞开始松散后，加入血清以终止消化，轻柔吹打细胞，将其收集至15ml离心管内，进行离心并弃去上清。

### 破骨细胞的诱导分化

1. 使用诱导分化培养基（完全培养基+30ng/ml Murine M-CSF + 50ng/ml Murine RANKL）重悬细胞。

2. 按照预设的表格，铺入相应的细胞数及对应的体积。

3. 在培养分化过程中，每隔一天更换液体，通常在第三天即可观察到细胞的融合现象，形成多个核的细胞。需保持对融合情况的及时观察，因为融合后的破骨细胞在体外的存活时间较短，容易破裂。因此，需选择合适的时间终止分化并进行后续实验。

注：所有细胞因子的购买后，请遵循说明书指示进行溶解和稀释，严禁反复冻融。同时，诱导分化培养基需根据每次的用量进行配制，做到按需配制。