甘油菌种的复苏和保存是生物医疗领域中的重要环节，涉及几个关键步骤，包括菌种的保存、复苏和再次保存。以下是详细的步骤及注意事项：

菌种保存

首先，将菌种接种于LB液体培养基中，并在对数生长期时，当培养体系内出现明显浑浊时进行保存。准备50%浓度的甘油溶液，这可以通过等体积的蒸馏水和甘油混合获得。在确保无菌条件下，将菌液与50%浓度的甘油按1:1的比例混合，使得甘油最终浓度达到25%。

将混合液转移至2ml离心管中，并在-20°C冰箱内保存。在这种条件下，菌种的保存有效期可达1年。如果需要长期保存，建议在-70°C或-80°C下冻存，通常保藏时间在2-4年左右。

菌种复苏

在需要使用时，将保存的菌种放置于30°C水浴中进行解冻。解冻后，将菌液接种到固体培养基上，在适宜的条件下培养24-48小时，以恢复菌种的活性。

再次保存

复苏后的菌种可以在新的液体培养基中继续培养，并再次进行甘油保存。这一过程确保了菌种的长期保存和可用性，在生物医疗研究中尤为重要。

注意事项

确保所有使用的工具和容器都经过适当的灭菌处理，以避免污染。在操作过程中保持无菌条件，防止外界微生物的入侵。正确的保存和复苏方法对于保持菌种的活性和纯度至关重要。此外，保存温度对菌种的长期存活有很大影响，低温条件有助于延长保存时间。

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